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发酵设计链霉菌生产维生素Bdoc

时间:2018-12-28 09:48 来源:未知 作者:admin

  发酵设想链霉菌出产维生素B..doc

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  1 绪论 维生素B12是一种水溶性维生素。只需少量即能发生结果 为深红色结晶或结晶粉末又称为红色维生素(red vitamin)或氰钴胺维生素 B12具有普遍的心理感化,它参与体内甲基转换及叶酸代谢,推进神经髓鞘中脂卵白的构成,连结中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整,参与普遍的卵白质及脂肪代谢等。 计量单元为微克(mcg——microgram,即1/1000000克)。维生素B12黑色素是最次要的分类指征。它们在土壤平分布极广,大多在人工培育基上发展富强,少数是动物致病菌。因很多种是抗生素的发生菌并且发生抗生素的品种最多而出名(如链霉素)。在维生素B12维生素B维生素B12(VB12)为钴胺素(Cobalamin)类化合物,的分子中有4个还原性吡咯环联合在一路,这种构叫做咕啉,与核苷酸(二甲基苯异咪唑)及核糖相联,另一方面与D-1-氨基-2-丙醇相连,钴与核苷酸之N相偶联。化学上称氰钴胺素为维生素B,除CN后称钴胺至多。CN可为其他基团取代,成为分歧类型的钴胺素。一般称对哺乳类有心理感化的为钴胺素,称对哺乳类及微生物都有感化的为维生素B12。本文中维生素B12泛称此类物。 氰钴胺至多天然界很少,为人工合成产物,可从其他类型转换而来。是红色结晶,其活力为重金属及氧化还原剂所粉碎,但在短期高压消毒(12℃)不被粉碎,能在1:80水中,为中性,在H4.5~5时最不变。 辅酶B12(即5’-脱氧腺钳钴胺素)及甲基B(甲基钴胺素)为(人类)组织中最次要的辅酶形式。前者在线粒体内,后者在胞浆内,为合成蛋氨酸所必需者。它们对光不不变,光解后构成水钴胺素。在氰存鄙人变成氰钴胺素,维生素B12、B12a、B12b、B12c都可医治维生素B12的缺乏。 氰钴胺素分子式(CN能够其他基团取代 1.2.1 维生素B12提高叶酸操纵率,与叶酸一路合成甲硫氨酸(由合成)和胆碱,发生嘌呤和嘧啶的过程中合成氰钴胺申基前驱物质如甲基钴胺和酶B12,参与很多主要化合物的过程。维生素B12缺乏时,从甲基四氢叶酸上转移甲基的勾当削减,使叶酸变成不克不及操纵的形式,叶酸缺乏症 2)维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏维生素B12时,可惹起神经妨碍、脊髓变性,并可惹起严峻的精力症状。维生素B12缺乏可导致四周神经炎。小孩缺乏维生素B12的晚期表示是情感非常、脸色板滞、反映痴钝,最初导致贫血。 3)推进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A,参与三羧酸轮回,此中琥珀酰辅酶A与血红素的合成相关。 4)参与脱氧核酸(DNA)的合成,脂肪、碳水化合物及卵白质的代谢,添加核酸与卵白质的合成。 1.2.2 维生素B抗生素废液中提取 早在1952年美国T.R.Wood等人就发觉,当用加有钴化合物的培育基培育灰色链霉菌时,可大大提高维生素B12在整个培育液中的浓度,可是对于钴化合物的浓度要求要适量,过高的浓度会对菌体细胞发生毒性;还有研究表白,添加适量的氰化合物也同样可推进抗生素废液中B12雷同物的含量,但需严酷控制其用量 (二)放线菌发酵 自从人们发觉可从抗生素废液中提取获得维生素B12后,很多科学家将目光转向了采用放线菌,此中次要是链霉菌属中的灰色链霉菌和橄榄色链霉菌来发酵产维生素B12,于链霉素的生成,而一直未能使得维生素B12的发生处于主导地位,因而,我们应选出链霉素发酵歧路的环节酶,并将其抑止,如许便可大大提高维生素B12的得率,使得大量发生维生素B12成为可能维生素B12 1.2.4 维生素B的提取 对于维生素B12提取,不竭有新的方式提出,次要有两种,一种为溶剂提取法,另一种为离子互换树脂法 (一)无机溶剂提取 研究表白,采用两相夹杂溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶剂为苯甲醇和水的夹杂溶液,根基过程如下:发酵液—吸附(活性碳)—洗脱(吡啶)—浓缩—层析(Al2O3)—洗脱(甲醇)—收集红色液—浓缩—结晶 (二离子互换树脂法子互换树脂法提取跟着离子互换柱在工业上的普遍使用,人们测验考试用阴阳离子互换树脂来进行维生素的提取,并取得了较好的结果,过程如下所示:发酵液—阳离子树脂(LonacC-240)—阴离子树脂(LonacAC-300)—蒸馏水冲刷—收集红色液体部门—浓缩—冷冻干燥此后维生素B12的成长标的目的 针对目前国内维生素B12的成长情况,提出如下的成长标的目的: 搞好维生素B12发酵菌株的选育工作,同时可借助于紫外线诱变、原生质体融合等生物手艺工程手段,提高单株的产量 (2)进行高密度培育,起首添加生物量,以期提高单元发酵效率; 因为目前关于维生素B12的代谢路子和基因表达序列已根基研究清晰因而,可采用基因工程手段,使该基因片段能在宿主细胞中多次表达,并使其能不变遗传,将会是维生素B12发酵的一大革命; 研制新型的诱导剂,以进一步提高其产量; 研制高效公用的生物反映器,采用持续流加培育; 采用固定化手艺,将菌种包埋或吸附于载 菌种选育 2.1 菌种的来历 次要由发生,该菌是最大的一群放线菌,属放线菌目,链霉菌属。大都为腐生菌,好氧,革兰氏染色阳性。有发育优良的分枝菌丝,菌丝无横隔,分化为养分菌丝、气生菌丝、65孢子丝。孢子丝再构成分生孢子。孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异,是分种的次要识别性状之一。已报道的有千余种,次要分布于土壤中。已知放线mm。基内菌丝通明,在斜面背后发生淡棕色色素。 2.1.1 菌种选择性分手菌种选择性分手的步调一般是: 含微生物材料——材料的预处置——菌种的分手————菌种的选择和纯化。 1次要分布于土壤中2.2 菌种选育 育种手艺可分为天然分手、典范诱变育种手艺和现代生物手艺。在天然界中,因为菌种基因天然突变的机率很小,并且突变往往导致菌种退化,合适出产要求的突变很是难求,因而天然选育是比力迟缓和被动的过程。同时在天然分手过程中因为菌种的同源基因频频传代,易惹起菌种遗传上的退化。因而天然分手手艺目前在工业出产中仅用于维持菌种的优秀性状,达到纯化菌种、不变出产的目标,很少零丁用于菌种选育。在此采用诱变育种手艺。 2.2.1 诱变育种的根基道理 诱变育种的理论根本是基因突变。基因突变指的是DNA分子布局中的某一部位发生变化(又称点突变)。按照突变发生的缘由又可分为天然突变和诱发突变。所谓天然突变是指在天然前提下呈现的基因突变,而诱发突变是指用各类物理、化学要素人工诱发的基因突变。经诱变处置后,微生物的遗传物质,DNA和RNA的化学布局发生改变,从而惹起微生物的遗传变异。因为引进了有诱变剂的处置,故诱变育种使菌种发生突变的频次和变异的幅度获得了提高,从而使筛选获得优秀特征的变异菌株的几率获得了提高[6]。 2.2.2 诱变育种的一般步调 1.出发菌种 链霉菌属的灰色链霉菌,该菌株是B12,B12的发酵程度2.单细胞悬液的制备 在诱变有种中,采用心理形态分歧的单孢子进行诱变,如许不只能够使细胞或孢子平均接触诱变剂,还能够避免分手现象的发生。 3 诱变处置 仅仅采用诱变剂的理化目标节制诱变剂的用量常会形成误差,所以在诱变处置前,必然要先做诱变剂量对菌体灭亡数量致死曲线,选择合适的处置剂量,选择合适的剂量要多次试验才能确定。插手10ml无菌水于新颖斜面培育物,用接种铲将菌丝刮下,用玻璃珠打碎成菌丝碎片,经一层滤纸过滤,制成菌丝悬浮液。吸收5ml上述菌丝悬浮液于无菌培育皿中,置于波长为253.7nm、功率30W的紫外灯直下30cm处开盖、震动映照60s。按照B12生物合成路子和代谢调理理论,对B12发生菌进行了推理选育,经次紫外诱变B12 的高产菌株,通过初筛和复筛,并确定最佳的发酵前提,才能使链霉菌的出产能力充实阐扬出来 2.3 菌种的保藏 菌种保藏是进行微生物研究和微生物育种工作的主要构成部门,其首要使命是使菌种不灭亡,同时还要尽可能设法把菌种的优秀特征连结下来而不致向坏的方面成长。目前经常采用的菌种保留方式是低温冷冻保藏如液氮保藏法和冷冻干燥法。这两种方式的保藏结果的黑白取决于利用恰当的孢子培育基、斜面的培育温度和培育时间、孢子的浓度及添加恰当的庇护试剂。但这两种方式需要有真空干燥和冷藏设备,别的还需要庇护剂,在工业化出产中较少利用,一般仅用于菌种的持久保藏。国内在出产实践中,一般利用沙土管法和低温冻结保藏法。前者结果较好,操作简洁保留期在一年以上;后者的长处是存活率高,变异率低,利用便利法(a)在斜面上插手9 mL无菌水,用棉签悄悄洗下孢子,使孢子悬浮于无菌水中; (b)将洗下的孢子悬液倒入装有1 0颗直径为2—3 mm玻璃珠的三角瓶中,放在摇床上220 rpm,振荡l h摆布; (c)脱脂棉过滤孢子悬液,除去菌丝片段和固体培育基碎片; (d)3000 rpm离心1 5 min以使孢子沉淀,顿时倒掉上清液; (e)将离心管在振荡器上振荡几秒钟使孢子沉淀物分离于残存的无 菌水中; (f)插手无菌的40%甘油和5%乳糖,-200C冷冻保藏。 利用前需洗涤两次,充实去除甘油对孢子活力的影响。 3 培育基的设置装备摆设 3.1 培育基设置装备摆设的准绳 培育基是指可供微生物细胞发展繁衍所需的一组养分物质和原料,同时也为微生物发展供给除养分外的其他发展所需的前提。准绳上①满足必需的原料;②生化反映的根基前提(温度、溶氧和pH);③来历丰硕、价钱低廉、取材便利、质量不变;④培育基成分不影响下流产物的提取加工。 3.2 培育基类型 培育基能够按照用处能够分成孢子培育基、种子培育基和发酵培育基。孢子培育基 孢子培育基是供菌种繁衍孢子的一种常用固体培育基,对这类培育基的要求是能使菌体发展敏捷,发生数量多并且优良的孢子,而且不会惹起菌体变异。 种子培育基 种子培育基是供孢子抽芽、发展和大量繁衍菌丝体,并使菌丝体长的粗壮,成为活力强的“种子”。 3)发酵培育基 发酵培育基既要有益于发展繁衍,防止菌体过早衰老,又要有益于产品的大量合成。要求培育基的构成应丰硕、完全,碳、氮源要留意速效和迟效的互相搭配,罕用速效养分,多加迟效养分,还要考虑恰当的碳氮比,加缓冲剂不变pH值;而且还要有菌体发展所需的发展因子和产品合成所需的元素、前体和推进剂等。 3.3 的培育基及培育前提 30℃下培育7~10天摆布,转置于40C冰箱保留备用。 培育基: (1)斜面培育基:可溶性淀粉2%,黄豆饼粉1%,K2HP04 0.25%,NaCI 0.2%,MgS040.05%,CaC03 0.3%,琼脂1.8%,pH 6.5。 (2)种子培育基:可溶性淀粉1.7%,葡萄糖1%,黄豆饼粉1.5%,卵白胨0.5%,酵母粉0.5%,KN03 0.25%,NaCl 0.2%,CaC03 0.4%,pH 6.8。 (3)发酵培育基:淀粉4%,葡萄糖1%,黄豆饼粉1%,卵白胨0.5%,鱼粉1%,酵母粉O.3%,NaN03 0.075%,(NH4)2S04 0.15%,MgS04·7H20 0.35%,KH2P04 0.02%,CaC030.4%,pH 6.7-7.0。 以上培育基均在121℃下灭菌20min。 培育方式: 斜面培育:将涂有菌液或孢子悬液的斜面置于30℃、相对湿度40%~60%N恒温恒湿培育箱中培育7~10天。 种子培育:将适量新颖斜面或甘油管保藏的菌液接种至装有25mL种子培育基的250mL三角瓶中,置于220rpm、30℃的恒温摇床中培育40-48h。 固定化种子培育:将预处置过的固定化介质若干投至含有30mL种子培育基的摇瓶发酵培育:以8%接种量将种子液接入装有25mL发酵培育基的250mL三角瓶中,置于240rpm、25℃的恒温摇床中培育72—84h。 3.4 培育基的养分要求3.4.1 碳源 碳源是构成培育基的次要成分之一。其功能次要有两个:一是为微生物菌种的发展繁衍供给能源和合成菌体所必需的碳成分;二是为合成目标产品供给所需的碳成分。常用的碳源有糖类、油脂、无机酸和低碳醇等。糖类是发酵培育基中最常用的碳源,次要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等。葡萄糖是最容易操纵的碳源,几乎所有的微生物都能操纵葡萄糖。所以在本设想当选择了葡萄糖作为碳源。 3.4.2 氮源 氮源是形成细胞中所含卵白质、核酸、酶等成分,以及代谢产品中氮从来源的养分物质,所地中海拟无枝酸菌在发展时均可操纵无机氮源。工业出产中凡是利用的氮源有氨、铵盐和尿素。当培育基中碳源不足时,可作为弥补碳源。本设想采用的氮源有黄豆饼粉、鱼粉、卵白胨、硝酸钾。 3.4.3 无机盐及微量元素 pH,中和代谢过程中所发生的无机酸,尚需加人CaCO3。Co+是一种酶的激活剂,又是生物合成维生素B12的前体,凡是需插手极微量,K+有推进发展的感化,Na+与维持细胞渗入压相关,凡是插手0.25%摆布量的NaCl即可,添加用量会较着影响菌的发展繁衍。Mn2+、Mg2+对链霉菌菌丝发展有较着感化。Fe2+浓度跨越60ug/mg以上,就要发生毒性,显著影响链霉素的产量,而对菌丝体发展影响较小,一般合用量在20ug/ul摆布。 3.4.4 水 水是所有培育基的次要成分,也是微生物机体的主要构成成分。水是优良的溶剂,又是活细胞中一切代谢反映的前言物,还能够维持细胞中的渗入压,同时水又是热的优良导体,有益于散热,可调理细胞温度。 3.4.5 发展因子和推进剂 发展因子是微生物发展不成贫乏的微量无机物,如氨基酸,嘌呤,嘧啶,维生素等。酶的出产中所需的发展因子大多由天然原料供给。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁和酵母等,含有丰硕的发展因子。产酶推进剂一般是该酶的底物和底物雷同物,向培育基添加概况活性剂以改善细胞膜的通透性或诱导酶的生成,在必然前提下能够显著地推进出产。 灭菌 所谓灭菌,就是指用物理或化学方式杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。4.1 仪器灭菌 接种环使用火焰灼烧法灭菌;摇瓶、试管使用蒸煮法灭菌。颠末灭菌是仪器不要表露于空气中或于其它的未知仪器接触,并及时利用,免得再次带菌。 4.2 培育基灭菌.2.1 灭菌方式 灭菌,就是指用物理或化学方式杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方式有以下几种: 化学药剂能使微生物中的卵白质、酶及核酸发生反映而具有杀菌感化,如甲醛、氯、高锰酸钾、环氧乙烷等。 紫外线m的紫外线有灭菌感化,最常用的波长为2.537×10-7m的紫外线但紫外线的穿透力低不合用于培育基灭菌。 干热灭菌的前提为在160℃下保温1小时。合用于一些要求干燥的尝试器具和材料的灭菌。 湿热灭菌即操纵饱和水蒸气进行灭菌。凡是的蒸汽灭菌前提为在121℃(表压约0.1MPa)维持30分钟。 4.2. 培育基的湿热灭菌 本尝试采用湿热灭菌,前提为在121℃(表压约0.11MPa)维持30分钟。 对培育基进行湿热灭菌时,培育基中的微生物受热灭亡速度与残存数量成反比,即 式中:N 培育基中活微生物的个数;τ为微生物受热时间,s; κ为比灭亡速度,; 若起头灭菌时(τ=0),培育基中或微生物数为N0,将式(1)积分可得 上式被称为对数残留定律。此中N为经τ时间灭菌后培育基中活微生物数。 4.2. 培育基湿热灭菌的方式 ①分批灭菌 将先配制好的培育基放在发酵罐或其他容器中,通入蒸汽将培育基和所用设备一路灭菌的操作过程(合用于小型发酵罐)。 ②持续灭菌 将配制好的培育基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程。培育基的分批灭菌的错误谬误是对培育基成分粉碎大,起落温时间长,而持续灭菌时培育基在短时间内被加热到灭菌温度,短时间保温后被快速冷却,再进入早已灭完菌的发酵罐,如许不单能够节流时间,更主要的是削减了培育基的粉碎率,其流程图如图2所示。 图2 持续灭菌的流程图 4.3 空气除菌 大大都生物培育基都需要氧气,凡是以空气作为氧源。按照国度药品出产质量办理规范(GMP)的要求,生物成品、药品的出产场地业需要合适空气干净度的要求。过滤是空气除菌的次要手段,按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类:绝对过滤和相对过滤。过滤介质有棉花、玻璃纤维、活性碳等。.3.1 过滤除菌流程及设备 流程如下:采风塔——空气粗过滤器——空气压缩——机储气罐——冷却器——旋风分手器——冷却器——丝网除沫器——空气加热器——总空气过滤器。 设备如下: (1)采风塔:采风塔建在工场的优势头,高至多10米,气流速度8m/s。 (2)粗过滤器:次要感化是拦截空气中较大的尘埃以庇护空气压缩机,同时起必然的除菌感化,减轻总过滤器的承担。 (3)空气压缩机:感化是供给动力,以降服随后各设备的阻力。 (4)空气储罐:感化是消弭压缩空气的脉动。 要求:H/B=2~2.5 V=(0.1~0.2)V1 此中,H为罐高;B为罐直径; V1为空压机每分钟排气量(20℃,1×105Pa情况下)。 (5)旋风分手器:是操纵离心力进行气-固或气-液沉降分手的设备。感化是分手空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。 (6)冷却器:空压机出口温度气温在120℃摆布,必需冷却。别的在潮湿的地区和季候还能够达到降湿的目标。 (7)丝网除沫器:能够除去空气中绝大大都的20μm 以上的液滴和1μm以上的雾滴,一般采用规格为直径0.25㎜×40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。 (8)空气加热器:列管内走空气,管外走蒸汽。 (9)总过滤器:填充物按下面挨次安装:孔板→铁蒺藜→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁蒺藜→孔板。介质要慎密平均,压紧分歧,上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4间活性炭层为1/3空气除菌的目标是出去空气中的微生物,环节在于包管介质的干燥,要求空气湿度小于50%气净化系统流程,如图所示。 图3 空气净化系统流程图.3.2 无菌空气的检测 此刻采用的无菌尝试方式有肉汤培育法、斜面培育法和双碟培育法这里我们采用斜面培育法来查抄。具体方式如下: 500 m三角瓶内装斜面培育基50m,其构成为2%,黄豆饼粉1%,K2HP04 0.25%,NaCI 0.2%,MgS040.05%,CaC03 0.3%,琼脂1.8%,pH 6.5~7.0,接种后置扭转式摇床,(±1)℃下培育28h摆布备用。 种子扩大培育 种子扩大培育是指将保具有砂土管、冷冻干燥管处于休眠形态的出产菌种接入试管斜面活化后,再颠末扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培育而获得必然数量和质量的纯种的过程。本发酵属于级种子罐扩大培育,级发酵。设想流程如下: 孢子——锥形瓶——种子罐——发酵罐 种子制备的工艺流程如图3所示: 图 种子扩大培育流程图 5.1 尝试室种子制备 保藏在沙土管或冷冻干燥管中的菌种经无菌手续接入合适于孢子抽芽或菌丝发展的斜面培育基中,经培育成熟后挑选菌落一般的孢子可再一次接入试管斜面,对于产孢子能力强的及孢子抽芽、发展繁衍快的菌落能够采用固体培育基培育孢子,孢子可间接作为种子罐的种子,如许操作简单,不易污染杂菌。 5.2 出产车间种子制备 将出产菌种悬浮液用微孔接种法接入种子罐进行扩大培育,种子罐之间的转接采用压差接种法,种子罐接入发酵罐也采用压差接种法。 种子罐级数确定的准绳:①包管种子量足够,满足发展需求。 ②尽量削减级数,简化工艺,削减污染。 种子罐培育的目标是使种子量增大,以缩短发酵罐的发酵延滞期。属于放线菌,因其发展速度,采用级种子罐,级发酵。取接种量为10%。级种子罐用一个种子罐,体积为V=100×10%=1m3。二级种子罐用一个种子罐,体积为V2=10×10%=1m3。则一级种子罐也用一个种子罐,体积为V1=1×10%=0.1m3,一级种子罐到二级种子罐采用压差接种法。种子罐的体积按照接种量来确定。 5.3 影响种子质量的要素 影响种子质量的要素有原材料的质量,培育前提(温度、湿度、通气量)和斜面冷藏时间。出产过程中经常呈现种子质量不不变的现象,其次要缘由是原材料质量波动。原材料质量的波动,起次要感化是此中无机离子含量分歧。种子质量的节制能够通过菌种不变性查抄,无菌查抄,包管原材料质量和节制培育前提等。发酵过程的工艺节制6.1 发酵过程手艺道理 微生物发酵过程可分为:分批发酵、补料-分批、半持续(发酵液带放)和持续发酵。分批发酵是一种准封锁式系统。补料-分批发酵,即在分批发酵(一次性插手发酵罐内等发酵完全后放罐)的根本上,插手新颖的料液,也降服因为养分的不足导致发酵过早竣事。持续发酵是在发酵过程中一边补入新颖的料液,一边以附近的流放速放料,维持发酵液本来的体积。本设想采用半持续发酵,即在补料-分批发酵的根本上加上间歇放掉部门发酵液,放掉部门发酵液,再补入恰当料液不只弥补养分和前体并且代谢无害物被稀释,从而有益于产品的继续合成。.1.1 发酵过程中接种量的节制 接种量对发酵过程的影响很大,次要是影响菌体量,菌体的发展形态以及发酵液中溶氧情况,从而影响产酶。别离调查4%、%、%、%的接种量对菌体干重以及溶氧的影响。尝试成果得出,跟着接种量的增大,菌体量添加敏捷,接种量为%时,在发酵到36h时,菌体量达到最大。接种量过大,发酵前期菌体大量繁衍,发酵液敏捷变得稀薄,导致整个发酵系统溶氧程度下降,供氧不足,从而影响产。可见,接种量的选择对的合成有着很是主要的影响,从发酵各参数考虑,选择%的接种量较为合适。 6.2 发酵前提的影响 的发酵出产程度取决于出产菌种的特征和发酵前提(包罗培育基)的节制)。此中发酵前提包罗:发酵温度、溶氧、Ph培育基养分成分等。 6.2.1 温度对发酵的影响 菌体的发展和合成抗生素的代谢勾当都是在各类酶的催化下进行的,然而酶的催化感化需要有恰当的温度。从酶反映动力学来看,跟着温度的升高,酶的活性加强,反映速度加大,发展代谢加速,抗生素排泄期提前,但温渡过高,则酶易得到活性,菌体易敏捷衰老,发酵周期缩短,抗生素产量就降低,因而维持发生菌的发展和合成抗生素所需要的最适温度是抗生素发酵的主要前提。研究表白, 6.2.2 溶氧对发酵的影响 在进行工业化出产时,以此来确定发酵罐的通气量和搅拌功率。 6.2.3 对发酵的影响 无机氮源是决定产量的主要要素。据文献报道NH3-N能被菌体快速操纵并推进菌体发展, 6.2.4 无机盐对发酵的影响 盐是菌丝发展所必需的主要元素,能推进菌丝的发展,但在的发酵中,过多的盐会构成大量无活性的。而且在发酵罐培育时还发觉,在培育基中恰当添加磷酸盐,可延缓菌丝衰老、自溶,削减发酵液的泡沫,能够改善发酵液的质量,有益提取过滤。6.3 发酵过程中周期的节制 优化后的培育基.3.1 发酵过程中消泡的节制 发酵过程中泡沫较大,除在根本猜中插手0.1%泡敌外,还以(花生油:泡敌= 5:1)作为夹杂消泡剂于发酵过程中滴加节制泡沫。 6.3 染菌的节制 在工业发酵中,染菌轻则影响产物的质和量,重则倒罐,颗粒无收,严峻影响工场的效益。因而要采纳一些防治办法。节制染菌能够通过降低培育温度,调整补料量,调pH值,缩短培育周期等办法予以解救。若是前期染菌,应从头灭菌,补加一些养分,从头接种再用。中期染菌,应偏离杂菌发展前提,达到必然程度则能够提前放罐。后期染菌,若是染菌不多,对出产影响不大,严峻的话可提前放罐。可能呈现的非常发酵现象: (1)培育基变稀:可能是噬菌体污染或养分成分缺乏; (2)培育基过浓:会抑止微生物的发展,考虑可能是污水污染; (3)耗糖较慢:可能缘由是种子发展能力降低,检测种子能否阑珊,发酵前提能否合适,以及养分成分能否全面,特别留意缺磷; (4)pH值纷歧般:用缓冲对来调理,查抄能否染杂菌,碳氮比能否合适; (5)发展迟缓:最可能的缘由就是养分成分不足。 发酵过程中发酵热的热量均衡方程: Q发酵= Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射 10400~33500kJ/(m3·h)。 Q发酵=Gc(t2-t1)/V G—冷却水流量,L/h; c—水的比热容,kJ/(kg·℃); t1、t2,℃ V—体积,m3 7 下流加工 7 下流加工 下流加工过程是生物工程的一个构成部门,是生物化工产物通过微生物发酵过程、酶反映过程或动动物细胞大量培育获得,以上述发酵、反映液或培育液分手、精制相关产物的过程。 下流加工过程可分为4个阶段:①发酵液的预处置和固液分手;②细胞破裂;③初步纯化(提取);④高度纯化(精制)。 7.1发酵液的预处置(细胞碎片、核酸和卵白质的沉淀物);除去部门可溶性杂质和改变滤液性质,以利于提取和精制的成功进行。 发酵液的预处置:采用理化方式设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度,以利于过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子。(一)预处置的方式①高价无机离子的去除方式;②杂卵白质的去除;③发酵液的凝结和絮凝。 7.1.2 维生素B的提取 对于维生素B12提取,不竭有新的方式提出,次要有两种,一种为溶剂提取法,另一种为离子互换树脂法 无机溶剂提取 研究表白,采用两相夹杂溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶剂为苯甲醇和水的夹杂溶液,根基过程如下:发酵液—吸附(活性碳)—洗脱(吡啶)—浓缩—层析(Al2O3)—洗脱(甲醇)—收集红色液—浓缩—结晶 二离子互换树脂法子互换树脂法提取跟着离子互换柱在工业上的普遍使用,人们测验考试用阴阳离子互换树脂来进行维生素的提取,并取得了较好的结果,过程如下所示:发酵液—阳离子树脂(LonacC-240)—阴离子树脂(LonacAC-300)—蒸馏水冲刷—收集红色液体部门—浓缩—冷冻干燥 生素B 过滤发酵液,收集菌体,水解,调理pH值为中性,起首用酚-丁醇进行提取,再用酚-氯仿进行提取,酸化,加温释放,滤袋过滤,膜过滤,二次酸化,过层析柱,丙酮洗脱,收集洗脱液,干燥得B12。 别的,在发酵过程中无机酸的不竭堆集抑止了菌体发展,耽误了发酵周期,影响了维生素的产量和质量,研究表白采用两步发酵法可处理此问题,第一步是厌氧发酵,可提高细胞生物量;第二步是好氧发酵,以分化丙酸。具体到工业化出产还有待于进一步研究。 好氧发酵工艺是目前工业化出产B12 的次要工艺, 全球80%以上产量来自该工艺。 8 发酵罐的工艺设想 8.1 发酵罐的布局 由于属于放线菌,所以应采用好氧发酵设备。本设想采用通用式发酵罐。通用式发酵罐的次要构成部件有: ①罐体:发酵罐的次要布局,其内壁有挡板,感化是使液内充实湍流,使养分物质与菌体接触更充实,一般用4-6块挡板。 ②搅拌安装:次要功能是使罐内物料夹杂平均,搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式,搅拌轴要与罐体密封严实,防止漏液和染菌。搅拌转速为200r/min. ③传热安装:有夹套,列管等,这里采用外夹套。 ④通气部门:通过空气分布器将通入的无菌空气平均分布到发酵液中,发酵罐通风量0-12 h为1:0.67vvm ,12 h至发酵竣事通风量为1:(1.0-1.33)vvm 。分布器有单管式和环形管式。 ⑤消泡安装:用于消弭发生的泡沫,最无效的节制泡沫的体例为添加消泡剂。可是,因为消泡剂大多对菌体发展有抑止感化,故最常选用的简单适用的消泡安装是耙式消泡器,间接装在搅拌轴上,操纵机械力量改变泡沫概况张力,达到消泡目标。 ⑥进出料口:罐顶设有进料口,罐底有出料口。其他从属设备还包罗试镜、人孔、取样管等,用以观测和检修。 ⑦管道系统,包罗试镜、取样管、pH值探头、温度探头、溶氧探甲等,用以随时观测、调理和检修。 发酵罐设备的布局图,见附图 8.2 发酵罐的工艺尺寸 常用的机械搅拌通风密闭发酵罐的布局和次要几何尺寸已尺度化设想(见附图)。其几何尺寸比例如下: H0/D=2:1 H/D=2.5~4.0:1 d/D=1/3~1/2 W/D=1/12~1/8 B/d=0.8~1.0 h/D=1/4 单元全数为:m 发酵罐大小用公称体积暗示,V0=∏D2×H/4+0.15D3 此中:H0-发酵罐圆柱形筒身高度 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度 d-搅拌器直径 W-挡板宽度 B-下搅拌器距罐底的距离 S-搅拌器间距 h-底封头或顶封头高度 8.2.1 发酵罐的计较 年出产吨的出产日为天,发酵周期为天,清理及维修发酵罐总时间为1天,则发酵总时间为天,产量为g/L,发酵液预处置收率约为85%,提取时收率约为90%,浓缩干燥收率为95%,装料系数为70%。 一年需放罐的次数:/7=35次 每批次产:/35=0.05714吨 总提取率为:85%×90%×95%=72.675% 假设用一台发酵罐,则发酵罐的体积V=0.0×1000/5.7/72.675%/70% =19.7m3 所以选用V0=m3的发酵罐,则需发酵罐1个 由V0(公称体积)=Va(筒身容积)+Vb(底部)≈∏D2H0/4+0.15D3得 D=m(H0=2.0D) 那么:H0=2.0D=2.0×=6.2 m H=3D=3×3.1=9.3 m d=D/2=0.5×3.1=1.55m W=D/12=3.1/12=0.26m B=0.9d=0.9×1.55=1.4 m S=2d =2×1.55=3.1m h=D/4=3.1/4=0.775m 液面高度HL=0.7(H+h)=0.7×(+0.775)=7.05m 8.3 物料衡算 目标名称 单元 目标数 出产规模 t/a 2 年出产天数 产物日产量 d/a kg/d 8.16 产质量量 65% 倒罐率 发酵周期 % 2 7 发酵辅助时间 菌种培育时间 菌种培育辅助时间 接种量 发酵罐装料系数 发酵放罐单元 提取总收率 h h h % % u/mL % 12 10 10 70 1750 72.67 表8-1维生素B12发酵工艺目标 本设想采用1个发酵罐,每个为m3,产量为g/L, 发酵液预处置收率约为85%,提取时收率约为90%,浓缩干燥收率为95%,装料系数为70%。则: 每个发酵罐在一个发酵周期产量为: ×5.7×90%×85%×95%×0.7=57.995(kg) 那么1个发酵罐1年的总产量为: (×245/7)×1=(kg)=吨 故合适年产量为吨的出产要求。 8.3 发酵液构成衡算 0m3发酵罐的装料系数为0.7,则该罐的装料为: 0×0.7=14m3 由于发酵培育液的构成(%)为:1,黄豆饼粉1,卵白胨0.5,鱼粉1,酵母粉O.3,NaN03 0.075,(NH4)2S04 0.15,MgS04·7H20 0.35,K2HP04 0.02,CaC030.4,CoCl2 lug/ml 消泡剂0.04 因而, 0m3发酵罐的用量×1000×0.04=560 kg 20m3发酵罐的葡萄糖用量:×1000×0.01=168kg 20m3发酵罐的卵白胨用量:×1000×0.005=70kg 20m3发酵罐的黄豆饼粉用量:×1000×0.01=140kg 20m3发酵罐的鱼粉用量:×1000×0.01=140kg 20m3发酵罐的用量:×1000×0.003=42kg 20m3发酵罐的NaN0用量:×1000×0.00075=10.5kg 20m3发酵罐的(NH)2S04用量:×1000×0.0015=21kg 20m3发酵罐的MgS07H20用量:×1000×0.0035=49kg 20m3发酵罐的K2HPO4用量:×1000×0.0002=2.8kg 20m3发酵罐的CaC03用量:×1000×0.004=56kg 20m3发酵罐的CoCl2用量:×10-9 kg 20m3发酵罐的消泡剂用量:×1000×0.0004=5.6kg 维生素B12发酵车间物料衡算汇总见表3-2所示。 物料名称 2t/a出产的物料量/kg 每日物料量/kg 成品量/kg 发酵液量/ m3 种子液量/ m3 玉米淀粉量/kg (NH4)2S4用量/kg 葡萄糖用量/kg 卵白胨用量/kg 黄豆饼粉用量/kg 鱼粉用量/kg 用量/kg NaN0用量/kg K2HP4用量/kg MgS07H20用量/kg CaC03用量/kgCoCl2用量/kg消泡剂用量/kg 2000 68.95 19600 735 5880 2450 4900 4900 1470 367.5 98 1715 1960 4.9×10-7 196 8.16 2.8 0.28 80 3 24 10 20 20 6 1.5 0.4 7 8 2×10-9 0.8 表8-2维生素B12发酵车间物料衡算表 9 设想评价 通过两周的查找材料与总结,年产吨的发酵工艺设想已完成。通过筛选获得的高产菌株,菌种合成的能力获得提高。通过节制发酵培育基中的消融氧、pH、无机氮、温度等分歧物质的量和前提来优化的发酵工艺。贾教员和教员参 考 文 献 [1] [2] 张濂 .化学反映工程道理.华东理工大学出书社,2007年 [3]?俞俊棠,唐孝宣,邬行彦.新编生物工艺学(上、下册).北京:化学工业出书社,2005 []?韦革宏,杨祥.发酵工程.北京:科学出书社,2008 []?蒋新龙.发酵工程.浙江:浙江大学出书社,2011 []?张卉.微生物工程.北京:中国轻工业出书社,2010 []?葛绍荣,乔代蓉,胡承.发酵工程道理与实践.上海:华东理工大学出书社,2011 []?陈坚,堵国成.发酵工程道理与手艺.北京:化学工业出书社,2012 [] 周国庆、张红兵.化工工艺设想手册.化学工业出书社,1996年 [10]刘国诠.生物工程下流手艺.北京:化学工业出书社,2003.[11] 期刊论文?维生素B12分批与补料分批发酵的研究?- 天津科技大学学报 - 2006, 21(3) [12] 段开红.生物工程设备.高档教育出书社,2005.[13] 陈坚,李寅.发酵过程优化道理与实践化学工业出书社,2[14] 罗,郝常明. 维生素B12的研究及其进展[J]1中国食物添加剂 [15]周德庆.微生物学教程.[M〕北京:高档教育出书社,1993 中北大学2012年发酵工程课程设想仿单 第27页

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